菌種凍干（冷凍干燥）是一種通過低溫冷凍和真空脫水實(shí)現(xiàn)微生物長期保存的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。
一、菌種凍干的原理
冷凍干燥通過以下機(jī)制實(shí)現(xiàn)微生物的長期存活：
1. 低溫冷凍：菌種懸液在低溫（通常低于-40℃）下快速凍結(jié)，形成冰晶，抑制細(xì)胞代謝活動。
2. 真空升華：在真空條件下（<10Pa），冰晶直接升華為水蒸氣，避免傳統(tǒng)干燥導(dǎo)致的細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞。
3. 休眠狀態(tài)維持：最終菌種處于低溫、干燥、缺氧的環(huán)境，代謝活動幾乎停止，長期保持活性。
二、菌種凍干的方法
凍干工藝主要包括以下步驟：
1. 菌種準(zhǔn)備
· 選擇高活性、無污染的菌種，培養(yǎng)至對數(shù)生長期或穩(wěn)定期（如細(xì)菌24-48小時(shí)，酵母3天）。
· 對耐氧性差的菌種（如厭氧菌），需在保護(hù)劑中脫氧處理。
2. 保護(hù)劑配制
· 常用保護(hù)劑包括脫脂乳、海藻糖、甘油等，需根據(jù)菌種特性調(diào)整濃度（5%-20%）。
3. 分裝與預(yù)凍
· 分裝量一般為0.1-0.2ml/管，預(yù)凍溫度需低于菌種共晶點(diǎn)（通常-40℃至-80℃），時(shí)間不少于2小時(shí)。
4. 冷凍干燥
· 分為升華干燥（去除自由水）和解析干燥（去除結(jié)合水），總時(shí)長24-48小時(shí)，真空度控制在<5Pa。
5. 封存與保存
· 在真空狀態(tài)下熔封安瓿管，避光保存于2-8℃或-20℃以下。
三、菌種凍干工藝的重要性
凍干工藝參數(shù)直接影響菌種存活率和穩(wěn)定性：
1. 預(yù)凍速率：過快導(dǎo)致冰晶細(xì)小但溶質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)，過慢引發(fā)細(xì)胞脫水損傷。優(yōu)化速率（如1-10℃/min）可提升存活率。
2. 真空度與溫度：真空度<10Pa確保升華效率，加熱板溫度需低于菌種共熔點(diǎn)（通常-20℃至25℃）。
3. 干燥時(shí)間：不足會導(dǎo)致殘留水分（>3%）引發(fā)氧化，過長則增加能耗。需結(jié)合菌種類型調(diào)整（如香菇凍干優(yōu)化至7.27小時(shí)）。
四、菌種凍干保護(hù)劑配方的重要性
保護(hù)劑通過以下機(jī)制減少凍干損傷：
1. 滲透壓調(diào)節(jié)：如甘露醇、海藻糖平衡細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，防止冰晶機(jī)械損傷。
2. 玻璃化作用：海藻糖、脫脂乳形成玻璃態(tài)基質(zhì)，穩(wěn)定細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。
3. 抗氧化與修復(fù)：谷胱甘肽、維生素C清除自由基，保護(hù)酶活性。
典型配方示例：
· 革蘭氏陰性菌：甘露醇（8%）+海藻糖（5%）+維生素C（0.2%）。
· 肺炎鏈球菌：大豆胨（2%）+海藻糖（2%）+甘油（0.6%）+甘露醇（6%）。
五、菌種凍干設(shè)備的選擇
設(shè)備選型需綜合考慮以下因素：
1. 凍干面積與產(chǎn)能：實(shí)驗(yàn)室級設(shè)備（<0.2㎡）用于小批量研發(fā)，工業(yè)級設(shè)備（>0.5㎡）滿足大規(guī)模生產(chǎn)。
2. 冷阱溫度：推薦-80℃以下，確保高效捕水（避免坍塌）。
3. 溫控精度：板層溫度波動≤±1℃，支持梯度升溫程序。
4. 自動化與滅菌：配備CIP/SIP系統(tǒng)（如LYO凍干機(jī)），符合GMP標(biāo)準(zhǔn)。
推薦設(shè)備類型：
· 實(shí)驗(yàn)室：Pilot2-4M、Pilot2-4H、Pilot2-4T、:-55℃凍干機(jī),真空度調(diào)節(jié)，可以選擇凍干終點(diǎn)判斷。
· 工業(yè)級：LYO-1~LYO-50系列。
